Mechanism of cellular growth in the dark-grown Arabidopsis thaliana hypocotyl

Datum: 24 juni 2014

Locatie: UAntwerpen - Campus Groenenborger - Lokaal V0.09 - Groenenborgerlaan 171 - 2020 Antwerpen

Tijdstip: 14 uur

Organisatie / co-organisatie: Faculteit Wetenschappen - Departement Biologie

Promovendus: Agnieszka Karolina Boron

Promotor: Prof. dr. Kris Vissenberg

Korte beschrijving: Doctoraatsverdediging Agnieszka Karolina Boron - Faculteit Wetenschappen, Departement Biologie



Abstract

Tijdens dit doctoraatswerk heb ik verschillende genen geïdentificeerd die een rol spelen in het celelongatieproces van hypocotyls en wortelharen, en ik heb gedeeltelijk verklaard hoe ze dit verwezenlijken.

Planten hebben een flexibel groeimechanisme dat hen in staat stelt om te overleven in een continue veranderende omgeving. Hun groei wordt verwezenlijkt door twee processen, een verhoging van het aantal cellen door celdeling en het toenemen in volume van deze cellen door elongatie. Beide processen worden uitgebreid bestudeerd in de modelplant Arabidopsis thaliana. Eén van de organen, het hypocotyl, wordt frequent gebruikt om het elongatieproces te bestuderen aangezien alle delingen aflopen in het embryo voordat verdroging van het zaad optreedt en omdat de groei in het donker zeer opvallend is. 

De cellen van donker-gegroeide hypocotylen kennen twee groeifasen, namelijk een eerste fase waarbij alle cellen traag en synchroon elongeren, gevolgd door een tweede fase waarin cellen aan de basis van het hypocotyl een groeiversnelling door elongatie ondergaan. Wanneer deze cellen maximaal geëlongeerd zijn, kennen de buur-cellen eenzelfde groeiversnelling, en dit loopt verder richting de top van het hypocotyl. Wanneer hypocotylen aan licht blootgesteld worden, wordt een hele nieuwe signaalcascade geïnitieerd, waarbij transcriptiefactoren zoals HY5/HYH voor een de-etiolatie zorgen. Dit proces wordt gekenmerkt door een snelle afremming van de elongatie van de hypocotylcellen, en door een accumulatie van chlorofyl en anthocyanen. Dit doctoraatswerk richt zich vooral op het verder verklaren van de groei van geëtioleerde Arabidopsis hypocotylen en is gebaseerd op transcriptoom-analyse en metingen van celwand-biomechanica.

Een transcriptoomanalyse, uitgevoerd door een samenwerkend labo, op verschillende tijdstippen tijdens en na de groeiversneling van de hypocotylcellen vormde de basis om potentiële genen te selecteren die een belangrijke rol kunnen spelen in de controle van celelongatie. Door T-DNA insertie mutanten voor de geselecteerde genen te analyseren, werden lijnen met gewijzigde mature hypocotyllengtes verkregen. Voor de 86 geselecteerde genen werden in totaal 166 T-DNA-lijnen besteld waarvan 65 homozygote T-DNA lijnen fenotypisch werden bestudeerd. Deze aanpak leidde tot de identificatie van tien lijnen (van negen genen) met een geëtioleerd hypocotyl fenotype. Een FT-IR analyse werd uitgevoerd om na te gaan of wijzigingen in celwandsamenstelling aan de basis van de groeifenotypes kunnen liggen. Enkel in de T-DNA lijnen in een proline-rijk eiwit en in COBRA LIKE9, beiden gekenmerkt door langere hypocotylen, werd een celwandwijziging gevonden, namelijk een afname in cellulose. Hierna werd er een diepgaande studie uitgevoerd op twee allelen van At1g70990, een niet-gekarakteriseerd proline-rijk eiwit. Confocale analyse van transgene planten met promoter::reporter constructen toonde aan dat At1g70990 tot expressie komt in de wortels, hypocotylen en zaadlobben van zaailingen. Het eiwit zelf was terug te vinden in het cytoplasma en mogelijks in het ER. Via deze aanpak heb ik verschillende genen geïdentificeerd die een rol spelen in de controle van hypocotylcelelongatie. Verder onderzoek is nodig om te verklaren hoe de veranderde genexpressies resulteren in de waargenomen groeiwijziging.

De micro-array identificeerde eveneens een ander gen dat tot expressie komt in het hypocotyl en wortelharen. Deze laatsten worden gevormd op wortelepidermis-cellen en elongeren door een speciale vorm van groei, namelijk tipgroei. Fylogenetische analyse gekoppeld aan vergelijking op eiwit-sequentie niveau wees uit dat het geïdentificeerd gen codeerde voor een proline-rijk eiwit. We noemde het gen dan ook proline-rijk protein-like 1 (AtPRPL1). Knock-out lijnen in AtPRPL1 hadden kortere wortelharen dan de wild types, terwijl overexpressie resulteerde in toegenomen wortelhaarlengtes. Analyse van promoter::reporter en GFP-proteïne fusie lijnen wees op een zwakke expressie in het hypocotyl, maar eveneens op een sterke expressie in de wortelharen. Het eiwit zelf bleek gelokaliseerd in vesikels die over de ER bewegen. FT-IR analyse duidde op minieme veranderingen in de celwandsamenstelling, maar zoals bij de andere PRP-eiwitten, is de precieze rol van AtPRPL1 in het elongatie proces nog onduidelijk.

Expansines zijn gekend voor hun celwand-losmakende eigenschappen, maar er is niet veel bekend over expansine-achtige eiwitten. We identificeerden en karakteriseerden AtEXLA2, een lid dat sterk tot expressie komt in hypocotylen en elongerende cellen van andere organen. Het AtEXLA2-eiwit bevat een cellulose-bindend domein maar, in tegenstelling tot conventionele expansines, geen katalytisch deel. Er werden fenotypische en extensiometrie analyses uitgevoerd om het effect van overexpressie op de ontwikkeling en op de celwandbiomechanica van Arabidopsis thaliana te bestuderen. AtEXLA2 bleek een positieve invloed te hebben op hypocotylgroei, deels door een toegenomen celwandextensibiliteit onder hoge belasting. Dit wordt mogelijks veroorzaakt doordat AtEXLA2 interfereert met het metabolisme, de afzetting of de assemblage van cellulose.

Tijdens deze thesis heb ik ook verder gewerkt aan de karakterisatie van een Arabidopsis mutant met een sterk verhoogde hypocotyl groei in het licht en een minder toegenomen groei in een donkere omgeving. We noemden deze mutant apollo. Genetische analyse toonde aan dat een T-DNA zich gepositioneerd had in de zone tussen twee anti-parallel georiënteerde genen, met een invloed op de expressieniveaus van beide genen. Een cellulaire analyse maakte duidelijk dat het apollo fenotype veroorzaakt wordt door een wijziging in celelongatie en niet in een verhoogde celdelingsfrequentie. Extensibiliteitstesten bevestigden dat de celwanden een lichte toename hebben in uitrekbaardheid tov wild types. Voorts was er een miniem verschil in het chlorofylgehalte van wild-type en apollo zaailingen wanneer ze in het licht gegroeid werden. Het ontbreken van detecteerbare wijzigingen in celwandsamenstelling toonde aan dat het metabolisme en de afzettingen van de celwand niet geaffecteerd waren. Uit een gedetailleerde analyse van de T-DNA-insertieplaats bleek dat het T-DNA precies in een site II element plaats had gevat, een element dat door minstens zes verschillende transcriptiefactoren kan herkend worden. Samenvattend kan gesteld worden dat apollo niet in staat is om volledig te de-etioleren wanneer licht gedetecteerd wordt.

Om groeiwijzigingen te kunnen koppelen aan mogelijke veranderingen in de fysische eigenschappen van de celwand, wordt vaak extensiometrie gebruikt. In dit werk werden 3- en 4-dagen-oude geëtioleerde Arabidopsis hypocotylen met een duidelijk verschillende groeisnelheid uitgerokken onder een constante belasting met behulp van een extensiometer. Dit heeft samen met groei-data geholpen om verschillen in groei te verklaren op de verschillende leeftijden.