Studie naar de initiatie en groei van Arabidopsis thaliana wortelharen.

Datum: 25 september 2014

Locatie: Campus Groenenborger - Lokaal V0.08 - Groenenborgerlaan 171 - 2020 Antwerpen

Tijdstip: 14.30 uur

Organisatie / co-organisatie: Departement Biologie

Promovendus: Daria Balcerowicz

Promotor: Kris Vissenberg

Korte beschrijving: Doctoraatsverdediging Daria Balcerowicz - Departement Biologie



Abstract

Cellen nemen tijdens hun ontwikkeling verschillende vormen aan die in vele gevallen hun functionele specificatie in de organen weerspiegelen. In planten hangt de ontwikkeling van de vorm strict samen met veranderingen in de celwand, aangezien celwandloze cellen, protoplasten, sferisch zijn. Het merendeel van plantcellen expandeert via diffuse groei, wat impliceert dat extensie over de hele celoppervlakte plaatsvindt. In sommige cel types gebeurt expansie in een strict afgebakende zone, hetgeen leidt tot de vorming van buisvormige structuren. Deze vorm van expansie, tipgroei genaamd, heeft een belangrijke rol gespeeld bij de kolonisatie van land door planten. Wortelharen, kleine uitgroeiingen van bepaalde wortelepidermiscellen, zorgen voor een oppervlaktevergroting van de wortel. Ze spelen een rol bij de opname van water en nutriënten, plantverankering in de bodem en de interactie met bodembewonende organismen. Daarenboven is tipgroei onontbeerlijk voor de voortplanting en overleving van planten. Pollenkorrels die terechtgekomen zijn op de stigma, maken pollenbuizen aan die op een sterk gepolarizeerde manier doorheen het vrouwelijke weefsel groeien om spermacellen af te zetten in de ovules.

Wortelharen van Arabidopsis thaliana worden vaak aangewend om tipgroei te bestuderen. Tot nu toe werden reeds vele mutaties geïdentificeerd die verscheidene stadia van wortelhaarontwikkeling beïnvloeden. Vele componenten van het complex genregulatorisch netwerk dienen echter nog te worden ontdekt. Om onze kennis van wortelhaargroei uit te breiden heeft het samenwerkend labo van Dr. Grierson een analyse uitgevoerd op twee Affymetrix ATH1 transcriptoom datasets van wortelepidermiscellen behorende tot wortelhaarmutanten. De eerste set werd gegenereerd door het transcriptoom van wild type en de rhd2 mutant te vergelijken. De twede set vergeleek FACS mRNA van de wer/myb23 dubbele mutant die wortelharen op elke epidermiscel produceert, en de cpc/try dubbele mutant, die geen haren vertoont. Deze aanpak identificeerde 151 genen met een mogelijke rol in wortelhaarmorfogenese. In deze studie worden enkele van deze genen indetail bestudeerd.

In hoofdstuk 1 bespreken we de clonering en karakterisatie van Arabidopsis thaliana kinase At5g61350, dat we MAIA genoemd hebben naar de Romeinse godin van groei. MAIA behoort tot de receptor-achtige kinases (RLKs) van de Catharanthus rosues subfamilie waarvan leden fungeren als sensoren gedurende polaire groei. Analyse van de transgene promoter-reporter lijnen toonde aan dat MAIA enkel tot expressie komt in wortelharen, pollen en pollenbuizen, hetgeen dus maakt dat het een tipgroei-specifiek RLK is. Via een reverse genetic aanpak hebben we aangetoond dat een verlies-van-functie mutatie in MAIA tot een 80% reductie van wortelhaargroei leidt en tot een verminderde pollenbuis-competitiviteit. De overexpressie van MAIA zorgt daarentegen niet voor een aantoonbaar fenotype, waarschijnlijk door een gelimiteerde beschikbaarheid van het substraat, of doordat MAIA reeds in een gesatureerde hoeveelheid aanwezig is in het wild type. Transcriptoom analyse van auxine-behandelde wortels bewees dat MAIA auxine-induceerbaar is. Chromatine immuno-precipitatie (ChIP) gevolgd door gen-specifieke qPCR suggereerde eveneens dat de promoter van MAIA direct gebonden wordt door een auxine-afhankelijke transcriptiefactor (ARF19), hetgeen aantoont dat MAIA direct door auxine gereguleerd wordt.

In hoofdstuk 2 tonen we dat tipgroei ook afhankelijk is van de activiteit van een receptor-achtig cytoplasmatisch kinase (RLCK) behorend tot klasse VII. At3g07070, PERSEUS (PER) vernoemd naar de griekse held, werd geselecteerd via de analyse van een co-expressie netwerk dat aangemaakt werd voor MAIA. Analyse van de promoter activiteit toonde dat de expresie van PER gelimiteerd is tot wortelharen en pollen(buizen), zoals MAIA. Daarenboven is PER eveneens auxine-afhankelijk en een direct doelwit van de transcriptiefactor ARF19. Fenotypische analyse van per-planten toonde aan dat de mutatie zorgt voor wortelhaarvertakking en dat het de pollenkieming sterk reduceert. Tot nu toe werd voor geen enkel ander lid van klasse VII RLCKs een rol toebedeeld in tipgroei. Onze fenotypes definiëren dus een nieuwe functie voor deze subfamilie. Aangezien nog andere familieleden een expressie in wortelharen en/of pollen(buizen) zouden moeten hebben (voorspeld via in silico analyse), kunnen ze een gelijkaardige functie hebben. Daarom bekeken we een collectie T-DNA lijnen voor deze genen en identificeerden we enkele nieuwe genen met een belangrijke rol in vooral pollen ontwikkeling (hoofdstuk 3), die als basis kunnen dienen voor toekomstige studies.

We bestudeerden eveneens NET2D (At2g22560), een lid van een recent ontdekte familie actine-bindende eiwitten (hoofdstuk 4). NET2D komt tot expressie in wortelhaarcellen vanaf het moment dat deze het meristeem verlaten, hetgeen suggereert dat NET2D een rol speelt ergens vroeg in de haarontwikkeling en mogelijk zelfs direct onder controle van wortelhaaridentiteits-bepalende eiwitten. De net2d mutant had een kleine reductie in wortelhaarlengte, waarschijnlijk door functionele redundantie. NET2D komt eveneens tot expressie in pollen(buizen) en speelt er een rol in de pollenkieming aangezien net2d een lagere pollenkieming heeft (reductie met 18% ).

In het laatste hoofdstuk bestuderen we de rol van twee onbekende eiwitten, RSH4 (At1g30850) en RSH4-like (At2g34910) in wortelhaargroei. De afwezigheid van één van beide genen zorgt niet voor een aantoonbaar groei-fenotype, maar de dubbele mutant rsh4/rsh4-like vertoont significant kortere wortelharen. Via transgene planten toonden we aan dat RSH4 exclusief tot expressie komt in wortelhaarcellen en dat beide eiwitten in het cytoplasma en de kern voorkomen.