Advances in methodology for the analysis of DNA interacting proteins by native ion mobility mass spectrometry.

Datum: 21 maart 2016

Locatie: UAntwerpen, Campus Groenenborger, Gebouw V, V0.08 - Groenenborgerlaan 171 - 2020 Antwerpen

Tijdstip: 16 uur

Organisatie / co-organisatie: Departement Chemie

Promovendus: Annika Kotter

Promotor: Frank Sobott

Korte beschrijving: Doctoraatsverdediging Annika Kotter, Faculteit Wetenschappen, Departement Chemie



Abstract

Veel functies van nucleïnezuren (DNA, RNA) zijn afhankelijk van zowel hun 3D-structuur als hun interacties met eiwitten. Begrip van deze interacties tijdens verschillende fases van de celcyclus en tijdens eiwitexpressie is noodzakelijk om de moleculaire basis van (infectie)ziektes te begrijpen. Eiwitten die interageren met nucleïnezuren spelen veelal een belangrijke rol in de structuur en activiteit van het genoom. In deze thesis wordt aangetoond dat zowel natieve ionenmobiliteit-massaspectrometrie (IM-MS) een krachtige methode is om deze eiwitten te bestuderen, als ook hun complexen met DNA, inclusief de analyse van de samenstelling en structuur van belangrijke complexen en hun werkingsmechanisme. Door middel van natieve IM-MS is het mogelijk om tegelijkertijd de massa, lading, grootte en vorm van moleculaire complexen te bepalen. Dit werk behandelt ook de ontwikkeling van nieuwe methoden voor natieve massaspectrometrie van eiwitten en eiwit/nucleïnezuurcomplexen, en het gebruik van modelleringmethoden om te assisteren bij data-interpretatie en de globale structuur van complexen te bepalen.

Gebruikmakend van een brede waaier aan IM-MS technieken, werd de toepassing van deze techniek geoptimaliseerd op zowel eiwitten die met DNA interageren, als op DNA/eiwitcomplexen. Hieruit bleek dat recent beschreven allosterische inhibitoren een ander hebben op het virale eiwit NS3/4A, afkomstig van hepatitis C, dan protease inhibitoren die binden op de substraatbindende site. In combinatie met klassieke methodes zoals isothermale calorimetrie en waterstof/deuteriumuitwisseling, hebben de in dit werk ontwikkelde technieken aanzienlijk potentieel voor de snelle analyse van structurele effecten van potentiële medicinale moleculen.

In het kader van het onderzoek naar SMC-eiwitten, werd de stoichiometrie van de complexen bepaald. Daarnaast werd een niet eerder waargenomen dimeervorming van de functionele SMC-complexen ontdekt. In de in deze studie beschreven experimenten werd structurele flexibiliteit vertoond door zowel de SMC-eiwitten, waarvoor vaak een staafvormige structuur wordt aangenomen, als door hun interactiepartners en andere eiwitten die een rol spelen bij hun functioneren. Bij de vergelijking van twee bacteriële SMC-systemen werden zowel overeenkomsten als verschillen aangetoond wat betreft hun stoichiometrie en werkingsmechanisme. Gebruikmakend van verschillende types IM-analyse, werd het conformationele ‘landschap’ van SMC-dimeren en gemuteerde varianten onderzocht. Dit werk werd ondersteund met behulp van doorgedreven in silico modellering enerzijds, en alternatieve massaspectrometrische methoden (crETD, CIU) anderzijds, met als doel het beoordelen van structurele modellen voor de geobserveerde conformaties in IM-MS, en om aan te tonen dat deze geen artefacten van de gebruikte methode zijn. Ten slotte werd de stoichiometrie van Type III restrictie-enzymen bepaald, en werd aangetoond dat een exemplaar van het complex bindt met een herkenningssite van DNA, zonder dat de stoichiometrie van het complex hierbij verandert. Na toevoeging van ATP, wordt het DNA geknipt en ‘glijdt’ het complex van het DNA, zonder dat er aanwijzingen bestaan voor grote conformationele veranderingen.