The development and application of novel methods for top-down and structural proteomics

Datum: 21 oktober 2016

Locatie: UAntwerpen, Campus Groenenborger, U0.25 - Groenenborgerlaan 171 - 2020 Antwerpen (route: UAntwerpen, Campus Groenenborger)

Tijdstip: 14 uur

Organisatie / co-organisatie: Departement Chemie

Promovendus: Frederik Lermyte

Promotor: Frank Sobott & Dirk Valkenborg

Korte beschrijving: Doctoraatsverdediging Frederik Lermyte - Faculteit Wetenschappen, Departement Chemie



Abstract

Bij vrijwel elk proces dat plaatsvindt in levende organismen zijn eiwitten betrokken. Hoewel deze biopolymeren zijn opgebouwd uit een beperkte set van slechts twintig aminozuren, nemen zij zeer diverse driedimensionale structuren aan, en deze zijn cruciaal voor hun functie. De interactiepartners van een eiwit en de architectuur van de resulterende complexen zijn ook kritiek voor hun biologische functie. Een afwijking op eender welk van deze niveaus leidt vaak tot ziekte en/of de dood, en bijgevolg is er duidelijk nood aan analytische technieken die (1) gevoelig zijn voor meerdere (bij voorkeur alle) niveaus van eiwitstructuur, (2) een breed toepassingsgebied hebben, en (3) slechts een minimum aan tijd en staalvoorbereiding vereisen.

Massaspectrometrie (MS) is de methode bij uitstek voor de snelle bepaling van de primaire structuur (d.w.z. soort en volgorde van aminozuren) van eiwitten. Het is echter belangrijk te beseffen dat, alhoewel een verandering in primaire structuur vaak een effect heeft op hogere structurele niveaus, een ‘klassiek’ MS-experiment op zich niet gevoelig is voor 3D-structuur. Met andere woorden, indien een eiwit twee verschillende structuren kan aannemen, zullen deze hetzelfde gedrag vertonen en moeilijk of niet te onderscheiden zijn.

Door experimentele omstandigheden zorgvuldig te beheersen, is het tegenwoordig mogelijk om eiwitten in het vacuüm van de massaspectrometer te brengen en toch de biologisch relevante 3D-structuur te behouden. Deze aanpak wordt ‘natieve’ massaspectrometrie genoemd. In deze thesis wordt het gebruik van natieve MS onderzocht in combinatie met twee andere nieuwe technieken, namelijk elektronentransferdissociatie (ETD) en ionenmobiliteitspectrometrie. Het doel is om meer gedetailleerde informatie te bekomen over (veranderingen in) 3D-structuur in de gasfase dan mogelijk is via conventionele massaspectrometrie.

In dit onderzoek werd aangetoond dat ETD informatie onthult over het oppervlak en manier van ontvouwing van grote, niet-covalente eiwitcomplexen. Verder laten we zien hoe bepaalde nevenreacties kunnen worden bevorderd, met als resultaat de vereenvoudiging van ‘drukke’ massaspectra. We hebben ook software ontwikkeld om te helpen bij de verwerking van de enorme hoeveelheden data die gegenereerd worden via massaspectrometrie. We beginnen met een methode voor de nauwkeurige (afwijking doorgaans beperkt tot ongeveer 0,0001%) schatting van de mono-isotopische massa van een intact eiwit (die doorgaans niet rechtreeks kan worden gemeten), wat in de toekomst kan leiden tot sneller en meer betrouwbaar vergelijken van experimenteel gedetecteerde eiwitten met gegevens in een database. Verder laat een ander algoritme toe om de relatieve waarschijnlijkheid (en dus snelheid) van verschillende nevenreacties bij ETD te bepalen. In dit kader ontdekten we dat de uitputting van bepaalde reactieproducten structuurafhankelijk is, wat kan gemeten worden met deze software. Bijgevolg kunnen we stellen dat dit soort analyse een nieuw ‘venster’ biedt op (verandering van) eiwitstructuur op meerdere niveaus in de gasfase.



Url: http://www.uantwerpen.be/wetenschappen