Bacterial leaf symbiosis in Fadogia en Vangueria (Rubiaceae) and the involvement of the endosymbiont in gousiekte

Datum: 3 februari 2014

Locatie: UAntwerpen - Campus Groenenborger - Lokaal U0.24 - Groenenborgerlaan 171 - 2020 Antwerpen

Tijdstip: 16.30 uur

Organisatie / co-organisatie: Departement Biologie - Faculteit Wetenschappen

Promovendus: Daan Van Elst

Promotor: Prof. dr. Els Prinsen

Korte beschrijving: Doctoraatsverdediging Daan Van Elst - Departement Biologie, Faculteit Wetenschappen



Abstract

Prokaryoten en eukaryoten leven op aarde al sinds miljoenen jaren tesamen.  Als gevolg van deze lange verbintenis ontstonden complexe samenwerkingen tussen verschillende soorten. Traditioneel worden microbiële infecties als nadelig beschouwd.  Echter, in de afgelopen decennia steeg de erkenning voor associaties die zowel voor gastheer als microbe voordelig zijn. Dit type van interactie wordt doorgaans geklasseerd als ‘symbiose’. Tijdens een vergelijkende studie naar de bladanatomie van Zuid Afrikaanse soorten uit de genera Pachystigma (nu Vangueria) en Fadogia van de  Rubiaceae namen Van Wyk en medewerkers (1990) een fijnkorrelige materie waar tussen de mesofylcellen in de bladlamina. Na microscopisch onderzoek werd duidelijk dat deze substantie in feite een massa is van bacteriën gehuld in een slijmlaag. De bacteriën ontdekt in Vangueria en Fadogia gelijken morfologisch sterk op de bacteriën van de bacteriële bladnodule symbiose gekend van drie  andere genera van de Rubiaceae. De bacteriën uit bladnodules zijn obligate endosymbionten. In het geval van de niet-nodulerende bladsymbiose in Vangueria en Fadogia is dit nog niet bekend. In de bladnodule symbiose van de Rubiaceae werden meerdere aanwijzigen gevonden van de inmenging van de endosymbiont in het plantenhormoon-metabolisme van de gastheerplant. Ons doel is het isoleren en identificeren van de bacteriën uit het weefsel van de niet-nodulerende Rubiaceae soorten. De pogingen om de endosymbiont uit de plant Fadogia homblei te isoleren waren succesvol. Slechts één bacteriesoort werd onderscheiden. Sequentieanalyse van het rrs gen en het recA gen toonde aan dat deze respectievelijk voor 100 % en 98 % gelijkaardig zijn aan de sequentie van die genen van Burkholderia caledonica LMG19076T. De niet-nodulerende endosymbiont behoort dus tot hetzelfde genus (Burkholderia), maar wordt niet ingedeeld in de groep met de nodule endosymbionten. Het feit dat we deze endosymbiont in axenische cultuur kunnen opkweken, betekent dat we het volledige gamma aan technieken kunnen gebruiken om deze endosymbiont-gastheer interactie te bestuderen. Op deze wijze werden de potentiële voordelige eigenschappen van de endosymbiont bepaald.  Onze analyse toonde aan dat de endosymbiont de mogelijkheid heeft om belangrijke plantengroeiregulatoren van de auxine en cytokinine klasse te produceren. Gibbereline plantenhormonen werden niet waargenomen. De productie van indool-3-azijnzuur (IAA) door de endosymbiont is hoog, zeker wanneer het medium verrijkt wordt met tryptamine, een auxine precursor die ook door de gastheerplant aangemaakt wordt.  Het fixeren van stikstof, dat niet plaatsvindt in de bladnodule, speelt geen rol in de niet-nodulerende symbiose aangezien bij de endosymbiont zowel de noodzakelijke genen ontbrekenals de mogelijkheid om zonder stikstofbron in het medium te groeien. Andere plantengerelateerde of voordelige eigenschappen zoals ACC deaminase activiteit, de productie van sideroforen, ‘quorum sensing’ moleculen en bacteriële biofilms werden vastgesteld. Er werd geen bewijs gevonden voor proteolytische activiteit of de mogelijkheid dat de endosymbiont de plantencelwand kan afbreken, ook werden er geen rechtstreekse schimmelwerende eigenschappen teruggevonden. De endosymbiont vertoonde ook een beperkt vermogen om aromatische componenten te metabolizeren. De endosymbiont groeit echter wel op media met salicylzuur als unieke koolstofbron. In planta condities zijn onbekend en ongetwijfeld meer gecompliceerd. Hoe bacteriële endosymbionten uit bovengrondse plantendelen bijdragen aan de ontwikkeling van de plant is nog slecht begrepen en in deze Burkholderia-Rubiaceae bladsymbiose zijn er nog geen voorgaande studies met betrekking tot het fysiologisch belang van de endosymbiont.

Dit onderzoek focust ook op een ander aspect gekoppeld aan plantensoorten met Burkholderia endosymbionten uit de Rubiaceae. Gousiekte, een hartaandoening van herkauwers in zuidelijk Afrika, wordt veroorzaakt door zes Rubiaceae soorten met endosymbionten, waaronder twee genoduleerde en vier niet-nodulerende soorten. Deze observatie heeft geleid tot de hypothese dat de bacteriële endosymbiont mogelijk betrokken is in de etiologie van gousiekte. De toxische component die gousiekte veroorzaakt, werd gekarakteriseerd als pavettamine, een polyamine. Om de hoeveelheid pavettamine te bepalen in biologische stalen werd een methode op punt gesteld die gebruik maakt van tandem massa spectrometrie. Deze gevoelige, nauwkeurige en snelle manier om de aanwezigheid en concentratie van pavettamine te bepalen, vormt een nieuw instrument in het begrijpen van de oorzaak, de ontwikkeling en mogelijk de diagnose van gousiekte. In axenische cultuur van de endosymbiont van de gousiekte-veroorzakende plantensoort Fadogia homblei kon geen pavettamine teruggevonden worden. Ook het bijstellen van de groeicondities naar omstandigheden die in het algemeen de productie van polyamines in bacteriën verhogen, had geen invloed op de productie van pavettamine door de endosymbiont. Gezien de detectielimiet van de meetmethode laag genoeg is om sporen van pavettamine te detecteren, kunnen we aannemen dat de endosymbiont alleen niet verantwoordelijk kan zijn voor de productie van pavettamine. De mogelijkheid bestaat dat beide partners nodig zijn voor de biosynthese van pavettamine. Om verder de rol van bacterie en plant in de productie van het toxine te onderzoeken, werden andere genoduleerde soorten en soorten zonder endosymbionten op de aanwezigheid van pavettamine gecontroleerd. Bijkomende pavettamine producerende soorten van deze plantenfamilie werden in deze doorlichting ontdekt. De meeste Rubiaceae soorten, waaronder ook Psychotria en Pavetta soorten met nodules en niet-nodulerende Vanguerieae, bevatten echter geen pavettamine. Dit is een bijkomende aanwijzing dat de bacteriën niet betrokken zijn in de productie van het toxine. Er werden van drie pavettamine positieve soorten celculturen bekomen om de productie van pavettamine verder te bestuderen. Deze celculturen bleken echter niet in staat om pavettamine aan te maken, hoewel andere polyamines wel gedetecteerd werden. Er werd gepoogd de pavettamine  productie op gang te brengen door het toevoegen van precursoren en via uitlokking met stresscondities en plantengroeiregulatoren. Deze pogingen bleken echter niet succesvol. Een nog onbekende stimulus is waarschijnlijk nodig voor het opstarten van de productie van pavettamine. Er is slechts weinig infomatie over de rol van pavettamine in de fysiologie van de plant beschikbaar. Een volledige doorlichting van de verschillende organen van de plant (wortel, blad, vrucht en stengel) toonde aan dat deze allen pavettamine bevatten, doch in andere grootteordes. De hoogste concentratie werd opgetekend in het zaad. Psychotria kirkii zaailingen werden verder gebruikt voor onderzoek naar de fysiologische aspecten van pavettamine aangezien het op celcultuur gebaseerde systeem niet werkzaam was. De media waarop dergelijke zaailingen werden gegroeid, werden aangerijkt met de potentiële pavettamine precursoren lysine en cadaverine. Er werd geen wijziging in de pavettamine concentratie waargenomen na additie van cadaverine, terwijl toevoeging van lysine de concentratie van pavettamine verhoogde. Echter wanneer isotoop gemerkte lysine toegevoegd werd aan deze zaailingen, werd er geen gemerkt pavettamine teruggevonden na massa spectrometrische analyse. De speculatie omtrent het idee dat lysine de precursor is voor pavettamine is daardoor niet juist. De vraag hoe pavettamine dan wel geproduceerd wordt, blijft tot op heden niet beantwoord.