Onderzoeksgroep
Expertise
Dit onderzoek vereist het kweken van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) en differentiatie in excitatoire corticale neuronen. Spontane, elektrische en medicijn-geïnduceerde neuronale activiteit wordt opgenomen met behulp van een high-density micro-electrode array (MEA). Uitvoer van MEA experimenten worden geanalyseerd met statistische programma's in GraphPad Prism en R scripts. Antisense oligonucleotide zijn ontworpen met behulp van online primers ontwerptools waaronder IDT OligoAnalyzer ™ Tool en handmatig gecureerd in SnapGene. Knockdown van hPSC KCNQ2 wordt gemeten met SYBRgreen en Taqman probe qPCR. Live imaging hPSC neuron experimenten worden uitgevoerd op een Incucyte S3.
Een nieuw in vitro antisense oligonucleotide-onderzoek naar neurotoxiciteitstoxiciteit.
Abstract
Antisense oligonucleotide (ASO) gentherapie wordt steeds vaker onderzocht voor de behandeling van neurologische aandoeningen. Recentelijk is echter bij een subset van behandelingen een acute in vivo neurotoxiciteit beschreven. Het mechanisme van deze toxiciteit is nog niet goed begrepen, maar in vitro-studies op knaagdierneuronen impliceren ASO-gemedieerde AMPA-receptorremming, wat een vermindering van intracellulair vrij calcium veroorzaakt. Mijn voorstel heeft tot doel de kenniskloof aan te pakken die verlaagd intracellulair calcium verbindt met in vivo toxiciteit, in een eerste menselijk neuron (iPSC) model. Op basis van voorlopige gegevens die ik heb gegenereerd, heb ik ASO-toxiciteit geïdentificeerd in gesynchroniseerde barstpatronen van neuronale netwerken, gemeten met behulp van een geavanceerde micro-elektrode-array met hoge dichtheid. Mijn voorstel zal broodnodige replicaten genereren die in vitro, intracellulaire calciumreductie beschrijven en een eerste test opleveren die longitudinaal het tijdsverloop van de neuronale functie met hoge resolutie kan meten bij blootstelling aan bekende toxische ASO's. Het begrijpen van het toxiciteitsmechanisme is een belangrijke stap in de richting van het verbeteren van toekomstige medicijnontwerpen en het ontwikkelen van in vitro-testen met hoge resolutie zal een belangrijk hulpmiddel voor het screenen van toxiciteit zijn voor het selecteren van leidende verbindingen voor in vivo testen.Onderzoeker(s)
- Promotor: Kaji Marcus
Onderzoeksgroep(en)
Project type(s)
- Onderzoeksproject
Elektrofysiologische en farmacologische karakterisering van iPSC afgeleide neuronale netwerken met behulp van een high-density micro-electrode array.
Abstract
Pathogene varianten in KCNQ2 en KCNQ3 (KCNQ2/3) leiden tot een spectrum van aandoeningen gaande van tijdelijke neonatale epilepsie tot epilepsie met ernstige verstandelijke beperking. Deze genen coderen voor spanningsgevoelige kaliumkanalen (Kv7.2/3) in het centrale zenuwstelsel die de neuronale prikkelbaarheid regelen. Er zijn meer dan 190 varianten geïdentificeerd, en van de meest klinisch relevante varianten is het effect op kanaalfunctie bestudeerd in niet-neuronale heterologe systemen. De relatie tussen Kv7.2/3 disfunctie en de mechanismen waarmee ze de neurologische ontwikkeling beïnvloeden, is echter nog ongekend. Ik stel voor om neuronen afgeleid van humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen met KCNQ2/3 varianten met gain- en loss-of-function effecten te gebruiken om de hypothese te testen dat pathogene varianten in KCNQ2/3 leiden tot een aberrante neuronale netwerkontwikkeling. Met een high-density microelectrode array zal ik de ontwikkeling tussen KCNQ2/3 varianten in uitsluitend excitatoire, en gemengde excitatoire:inhibitoire neuronale netwerken vergelijken. Ik zal de doeltreffendheid van kanaalactivatoren en -blokkers testen en nieuwe antisense oligonucleotiden ontwikkelen als een gerichte knockdown aanpak. Dit voorstel zal een afstembaar systeem opleveren om de neurologische ontwikkeling te bestuderen, om het potentieel als high-throughput geneesmiddelenscreening te valideren, en lead compounds te ontwikkelen voor de behandeling van Kv7.2/3 kanalopathie.Onderzoeker(s)
- Promotor: Weckhuysen Sarah
- Mandaathouder: Kaji Marcus
Onderzoeksgroep(en)
Project type(s)
- Onderzoeksproject